Гладышевский заказник образован совместным распоряжением Губернаторов Санкт-Петербурга № 103-р и Ленинградской области — р/89-рг от 26 июля 1996 года «Об организации комплексного заказника „Гладышевский“».
Заказник расположен в юго-западной части Карельского перешейка на территории двух субъектов Российской Федерации — Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Он занимает площадь 8,4 тысяч гектаров; девять десятых территории находится в Выборгском районе Ленинградской области, и только одна десятая — в Курортном районе Санкт-Петербурга.
Рядом с Гладышевским заказником находится заказник Линдуловская роща, внесённая в список Всемирного культурного и природного наследия ЮНЕСКО.
Водная система заказника включает Гладышевское озеро, из которого вытекает река Гладышевка. На территории Санкт-Петербурга она сливается с рекой Рощинкой и образует Чёрную речку. Река Чёрная, в свою очередь, впадает в Финский залив. Акватория залива в радиусе от устья реки также входит в состав заказника.
Название заказника произошло от Гладышевского озера и реки Гладышевки (финские названия соответственно Ваммельярви и Ваммельйоки), которые, в свою очередь, были названы в честь героя Великой Отечественной войны лётчика Николая Александровича Гладышева.
С 8 по 12 августа 2011 года на территории заказника был организован экологический лагерь в рамках российско-финляндского проекта по восстановление популяций лососёвых рыб в реках, протекающих по территории Финляндии и России. В эколагере проводились лекции и практические занятия сотрудниками различных институтов и экологических организаций. Слушателями были студенты Санкт-Петербургского государственного университета, Петрозаводского госуниверситета и Университета города Турку (Финляндия). В работе приняли участие администрация Выборгского района Ленинградской области и Дирекция Комитета по природным ресурсам Ленинградской области и Санкт-Петербурга. Проект завершён в 2014 году.